Anti-oxidant and Anti-inflammatory effects of Usnea diffracta Vain. extracts

Research Article
최 연  Yeon Choi 1*김 종두  Jong Du Kim2

Abstract

This study investigated antioxidant and anti-inflammatory in order to confirm the possibility of functional materials that can improve skin diseases using Usnea diffracta Vain. extracts. As a result of measuring DPPH and ABTS free radical scavenging activities, it was confirmed that 50%% ethanol, 70% ethanol, and 95% ethanol extracts had superior antioxidant activity compared to other solvent extracts. In particular, in the case of 70% ethanol, 95% ethanol extract, it was confirmed that the antioxidant ability was excellent even at a low concentration compared to other extracts. As a result of confirming the efficacy of reducing skin inflammation against 70% ethanol, 95% ethanol extract using the HaCaT cell line, it was confirmed that the protein level of the CCL17 and CCL22 cytokine increased by TNF-α and IFN-γ decreased dose-dependent, respectively. In conclusion, the 70% ethanol, 95% ethanol extract of Usnea diffracta Vain. is likely to be used as a functional material related to skin diseases in the future.

Keyword



Introduction

피부는 자외선, 미세먼지, 공해, 환경적인 스트레스 등 외부자극에 노출될 때 reactive oxygen species (ROS, 활성산소종)을 발생하며, 생성된 ROS는 세포 구성성분인 지질, 단백질, 당, DNA 등을 비선택적, 비가역적으로 파괴함으로써 각종 퇴행성 질환을 유발하는 것으로 알려져 있다[1,2]. 이처럼 생체 내에 생성된 산화스트레스는 생체 내 혈관 및 조직의 손상을 통해 염증을 유발할 수 있으며, 더 나아가 암, 동맥경화, 심장질환, 당뇨병 등 다양한 질병과 노화를 유발하는 원인이 되기도 한다[3~5, 13].

피부는 외부 유해 환경으로부터 신체를 보호하고, 박테리아나 바이러스 등이 몸속으로 침투하지 못하도록 막는 방어체계로 피부 면역체계의 이상은 대식세포와 같은 면역 세포가 병원균이나 바이러스 등의 외부 물질에 반응하여 식작용(phagocytosis)을 하거나 염증매개물질들을 분비하여 이들을 제거하는 과정을 포함하는 염증 반응과 관련된 피부질환의 발생을 초래하기도 한다[6~8]. 피부염증 완화를 위해서는 스테로이드나 타크로리무스(tacrolimus) 같은 비특이적 면역억제제나 항생제, 항히스타민제 같은 증상완화제로 근본적인 치료제가 없으며 항생제와 스테로이드는 장기복용 시 부작용으로 피부 발진, 색소침착, 알레르기 등의 부작용이 알려져 있어 부작용이 없으며 장기 사용할 수 있는 소재 개발이 필요한 실정이다.

소재 개발을 위한 연구에는 여러 사이토카인들을 생산하고 면역 및 염증반응에 관여하는 피부암 유래 각질 세포주인 HaCaT (Human Keratinocyte cell line) 세포를 사용한다. 피부의 각질세포는 다양한 외부 유해자극에 의해 Th2 케모카인으로 알려진 CCL17과 CCL22을 분비하며, 이 사이토카인들은 Th2 세포의 염증 부위로의 이동과 침윤을 유도하는 것으로 알려져 있다. 최근에는 아토피 피부염 환자의 혈청에서 Th2 케모카인인 CCL17과 CCL22가 매우 높은 농도로 검출되어 아토피피부염과 CCL17, CCL22가 서로 매우 밀접한 연관성이 있는 것으로 보고된바 있다[9,10].

송라 (Usnea diffracta Vain.)는 송라과에 속하는 지의류로 고산 지대에서 자라거나 온대 지방의 높은 산에서 한 대에 걸쳐서 자라는 것으로 보고되어져 있다. 세계적으로 송라는 약 3,000여 종이 관찰되었으나, 한국에서는 송라, 붉은 수염 송라, 솔송라의 단 3종만이 서식하는 것으로 보고되어있다. 예로부터 송라는 중국의 명 중기부터 청말까지 명차로 이름이 널리 알려져 있었고, 또한 많이 즐겨 음용 되었던 차로 알려져 있다. 송라는 예로부터 진통, 해열, 창상치료제 및 진해 거담제로 사용되어 왔으며[14, 15], 송라에는 여러 약리 작용을 가진 물질들이 존재하고 있는 것으로 보고되고 있다. 그 물질에 대한 효능으로 항균, 항바이러스, 항염증작용과 같은 다양한 생리활성 효능을 가지고 있음이 보고된바 있다. 또한 강력한 항암효과가 여러 연구를 통해 유방암의 성장과 혈관생성을 억제하고 악성 흑색종과 전립선암에 대한 증식, 전이를 억제함으로써 항암효과를 나타냄이 밝혀졌다. 따라서 본 연구에서는 송라 추출물에 대한 피부질환 개선용 소재로서의 가능성을 확인해 보고자 송라 용매 농도별 추출물에 대하여 항산화 활성과 HaCaT 세포를 이용한 항염활성을 살펴보았다.

Research method

1. 시료의 제조

본 실험에 사용된 송라는 시중에서 구입하여 실험에 사용하였다. 건조된 송라를 믹서기로 파쇄하고 각각의 파쇄된 분말 100 g에 100% 물, 30% 에탄올, 50% 에탄올, 70% 에탄올 및 95% 에탄올을 각각 800 mL를 첨가한 후 70℃에서 3시간 동안 가열 추출하였다. 추출액은 다시 여과지(Whatman NO. 2)로 여과하여 38℃에서 감압 농축한 다음 농축된 시료를 freeze dryer로 수분을 제거하고 분말화하여 –20℃에서 보관하고 에탄올에 녹여 실험에 사용하였다.

2. 항산화활성

1) DPPH radical 소거능

DPPH radical 소거능은 Blois 방법[12]에 준하여 측정하였다. 0.15 mM DPPH (Sigma-Aldirich Co.) 용액 190 μL와 각 농도별 시료 10 μL를 넣어 교반한 뒤 암실에서 30분간 반응시킨 후 ELISA reader (Bio-Rad Laboratories, Inc.)를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 항산화능은 항산화제로 잘 알려져 있는 vitamin C의 항산화능을 측정한 값과 비교하였다.

2) ABTS radical 소거능

2,2'-Azinobis(3-ethylenbenzothizoline-6-sulfonate)(ABTS) radical 소거능 측정은 Pellegrini 등의 방법[11]에 준하여 측정하였다. ABTS solution은 140 mM K2S2O8 (Sigma-Aldrich Co.) 176 μL와 7 mM ABTS (Sigma-Aldrich Co.) 10 mL를 혼합하여 암소에서 14-16시간 이상 반응시킨 후 이 용액과 에탄올을 1:88 비율로 혼합하여 제조하였다. ABTS solution 200 μL를 취하여 각 농도별 시료 10 μL를 혼합하여 암실에서 2분 30초간 방치한 후 ELISA reader (Bio-Rad Laboratories, Inc.)를 이용하여 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 항산화능은 항산화제로 잘 알려져 있는 vitamin C의 항산화능을 측정한 값과 비교하였다.

3. 항아토피 활성

1) 세포 배양 및 생존률 측정

Human keratinocyte cell line인 HaCaT cell은 10% heat-inactivated FBS와 1% penicillin-streptomycin이 첨가된 DMEM (Dulbecco’s modified Eagle Medium) 배지에서 37℃, 5% CO2 조건하에 배양하였다. 배양이 끝난 세포의 생존률은 MTT [3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide] 환원 방법을 이용하여 측정하였다. HaCaT cell을 96-well plate에 3×104 cells/well로 분주하고 37℃에서 배양한 후 송라 50% 에탄올, 70% 에탄올, 95% 에탄올 추출물을 30, 60 μg/mL 로 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 각 well에 20 μL의 MTT 용액을 첨가하고 3시간 동안 추가로 배양한 후 배양액을 제거하고 100 μL의 DMSO (dimethylsulfoxide)를 첨가하여 formazan을 녹인 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

2) CCL17, CCL22 ELISA assay

세포 내 CCL17, CCL22 정량은 ELISA법으로 측정하였다. 먼저, HaCaT 세포를 6 well plate에 각 well 당 1.5×105 cells/mL로 분주한 뒤, 5% CO2, 37℃ 조건 하에서 24시간 동안 배양하였다. 50% 에탄올, 70% 에탄올, 95% 에탄올 추출물을 농도별 (30, 60 μg/mL)로 1시간 전 처리한 후 염증반응 유도 군에서는 TNF-α와 INF-γ 50 ng/mL를 1시간 동안 처리하였다. 배양 후 media를 15 mL tube에 넣고 1,500 rpm, 10분 동안 원심분리 하였다. 배양액 내의 CCL17 및 CCL22 함량을 측정하기 위해 Human CCL17/TARC Quantikine ELISA kit 및 Human CCL22/MDC Quantikine ELISA kit (R&D Systems, Minneapolis, MS)를 사용하여 측정하였다. 실험과정은 세포배양액을 각 well에 분주하고 제공되는 표준시료를 주입하여 제조회사 에서 제시하는 방법에 준하여 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

4. 통계처리

본 연구에서 얻어진 실험결과는 평균(mean)±표준편차 (standard deviation; SD)로 표기하였으며, 통계처리는 SPSS 24.0 for windows program (Statistical Package for the Social Science, IBM SPSS, USA)을 이용하여 통계적 유의성을 분석하였다. 일원배치 분산분석(one-way analysis of variance)을 한 후, 각 시료간의 통계적 유의성은 Tukey's multiple comparison test를 이용하여 사후검증을 수행하였다.

Result

1. 송라 용매별 추출물의 항산화 활성

송라 에탄올 추출물에 대한 항산화 활성을 측정하기 위해 DPPH, ABTS 라디컬 소거능 및 FRAP radical 소거능 측정을 통해 항산화 효능을 평가하였다.

1) DPPH radical 소거능

DPPH radical 소거능 활성법은 시료의 free radical 소거 능력이나 수소 공여능력을 평가하는 방법으로서 식품을 비롯한 여러 분야에서 항산화 물질을 검색하는 데 널리 이용되고 있다.

각각의 송라 용매별 추출물에 대한 DPPH 라디컬 소거능을 측정한 결과(Table 1), 10 mg/mL 농도에서 30% 에탄올 추출물이 DPPH 라디컬 소거능 활성이 가장 높게 나타났으며, 50% 에탄올> 100% 물 > 70% 에탄올 > 95% 에탄올 추출물 순으로 DPPH 항산화 활성을 높게 나타내었다. 또한, 각 추출물에 대하여 5 mg/mL 농도로 낮추어 DPPH 항산화 활성을 비교해본 결과, 100% 물, 50% 에탄올 추출물의 경우 30% 에탄올, 70% 에탄올, 95% 에탄올 추출물과는 약 3-10% 높은 DPPH항산화 활성을 나타내었다. 그리고 1 mg/mL 농도에서는 각각의 추출물의 경우 DPPH 항산화 활성이 62.13% - 66.88%로 측정되었다.

본 실험은 대조구로 vitamin C를 사용하였으며, 대조구의 경우 1 mg/mL 처리에 의해서는 96.55%로 높은 DPPH 항산화 활성을 보였다. 이상의 결과(Table 1)에서 살펴보듯이, 50% 에탄올 및 100% 물 추출물이 다른 추출물과 비교하여 DPPH 항산화 활성이 대체적으로 높은 것으로 확인되었다.

Table 1. DPPH radical scavenging activities (%) of Usnea diffracta Vain. extracts

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1 All values are expressed as mean±standard deviation (n=3). 2 Positive control is vitamin C (1 mg/mL).

2) ABTS radical 활성

ABTS는 유리기들과의 반응으로 생성된 양이온 형태의 ABTS가 추출물에 함유된 다양한 활성화합물에 의해 환원되는 정도를 측정하는 것으로 DPPH와 함께 대표적으로 항산화 활성을 측정하는 방법으로 알려져 있다.

각각의 추출물을 1, 5 및 10 mg/mL 농도에서 ABTS radical 소거능을 측정한 결과(Table 2), 95% 에탄올 추출물에서 농도 의존적으로 가장 높은 활성을 나타내었으며, 그 ABTS radical 소거능은 각각의 농도에서, 67.23%, 76.56% 및 95.57%로 측정되었다. 그 다음으로 높은 활성을 보인 70% 에탄올 추출물의 ABTS radical 소거능은 62.78%, 70.60% 및 89.22%로 나타내었으며, 50% 에탄올 추출물은 각각의 농도에서 56.02%, 63.29%, 79.18%의 ABTS radical 소거능을 나타내었다. 30% 에탄올 추출물은 처리된 농도에서 34.51% - 69.76%의 ABTS radical 소거능을 보였으며, 100% 물 추출물은 26.54% - 56.49%로 가장 낮은 ABTS radical 소거능을 나타내었다. ABTS radiclal 소거능이 가장 높은 95% 에탄올 추출물의 경우 DPPH radical 소거능과 비교하여 낮은 농도인 1 및 5 mg/mL에서는 유사한 ABTS radical 소거능을 보였으나, 10 mg/mL 농도에서 약 15% 정도 높은 소거능을 나타내었다. 또한, 70% 에탄올 추출물의 경우 처리된 농도에서 약 5% 높은 ABTS radical 소거능을 보였으며, 30% 에탄올 추출물은 5 및 10 mg/mL 농도에서는 약 18%~22%, 1 mg/mL 농도에서는 28% 낮은 radiclal 소거능을 확인할 수 있었다. 50% 에탄올 추출물 및 100% 물 추출물은 1 mg/mL 농도에서 각각 약 6% 및 40% 낮은 ABTS radicla 소거능을 나타내었다.

이와 같인 각각의 추출물은 DPPH radical 소거능과 비교해보면 70% 에탄올 추출물과 95% 에탄올 추출물을 10mg/Ml 농도를 제외하고 전체적으로 낮은 ABTS radical 소거능을 보였다(Table 1 and Table 2). ABTS radical은 추출물에 함유된 극성 및 비극성 물질 모두와 반응하여 소거되는 것으로 보고되고 있으나, 본 연구의 송라 추출물들은 물과 에탄올 함유 비율에 따른 극성 차이와 추출되어 나온 성분의 차이로 인하여 DPPH radical 활성과 비교하여 낮은 활성을 보인 것으로 사료된다.

Table 2. Table 2. ABTS radical scavenging activities (%) ofU Usnea diffracta Vain. extracts

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1 All values are expressed as mean±standard deviation (n=3). 2 Positive control is vitamin C (1 mg/mL).

3. TNF-α/ INF-γ 유도된 HaCaT 세포에서 송라 용매별 추출물의 효능

피부각질세포를 포함한 다양한 세포에서 발현되는 케모카인 중 하나인 CCL17과 CCL22는 Th2 림프구의 염증 부위로의 이동과 침윤을 유도하는 것으로 알려져 있으며, 이들은 염증성 피부질환인 아토피 피부염 환자의 혈청에서 매우 높은 농도로 검출되어 아토피 피부염과 매우 밀접한 관련이 있는 것으로 보고되고 있다[9,10].

각각의 송라 추출물에 대한 항산화 활성 검증 결과를 살펴보면, 50% 에탄올 추출물 및 70%, 95% 에탄올 추출의 경우 다른 추출물과 비교하여 낮은 농도에서도 항산화 활성이 우수한 것을 확인할 수 있었다(Table 1-2). 우수한 활성을 보이는 50% 에탄올, 70% 및 95% 에탄올 추출물에 대하여 피부세포인 HaCaT 세포에서 CCL17 및 CCL22 단백질 생산 변화에 영향을 미치는지 ELISA assay를 통해 확인하였다(Figure 1). MTT assay를 이용한 세포독성 측정결과, 송라 70% 에탄올, 95% 에탄올 추출물은 30, 60 μg/mL 농도에서 80% 이상의 세포생존율을 나타내 처리한 농도에서는 세포독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다. HaCaT 세포는 아무런 처리도 하지 않은 대조군에 비하여 TNF-α와 IFN-γ를 동시에 처리한 실험군에서 CCL17 과 CCL22의 단백질 생산량이 각각 5.42 pg/mL 및 57.26 pg/mL로 측정되었다. 대조군으로 사용된 cyclosporin은 10 μM 처리 시 CCL17 과 CCL22의 단백질 생산량이 각각 2.01 pg/mL 및 43.75 pg/mL로 측정되었으며, TNF-α/IFN-γ만 처리한 실험군과 비교하여 CCL17 과 CCL22의 단백질 생산량이 감소한 것으로 확인되었다. 송라 70% 에탄올, 95% 에탄올 추출물을 30 및 60 μg/mL 농도로 처리 시 TNF-α와 IFN-γ에 의해 증가된 CCL17을 농도 의존적으로 감소시켰으며, CCL17 생산량은 각각 0.62 pg/mL, 0.35 pg/mL 및 0.12 pg/mL, 0.39 pg/mL 로 측정되었다. 또한 CCL22의 생산량은 각각 3.25 pg/mL, 3.21 pg/mL 및 3.26 pg/mL, 4.28 pg/mL 로 측정되었다(Figure 1). 송라 70% 에탄올, 95% 에탄올 추출물은 TNF-α/IFN-γ만 처리한 실험군과 비교하여 CCL17 생산량은 농도 의존적으로 감소시켰으며, CCL22의 생산량은 농도의존적으로 감소한 것으로 확인되었다.

이와 같이 송라 70%에탄올, 95% 에탄올 추출물은 대조군으로 사용된 cyclosporin과 비교하여 CCL17 과 CCL22의 단백질 생산량 억제 효과가 더 높게 측정되었으며, 이를 통해 송라 70% 에탄올, 95% 에탄올 추출물이 피부염증 질환인 아토피피부염 개선효능이 있을 것으로 판단된다.

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Fig. 1. Effects of 70% EtOH, 95% EtOH extract on CCL17 and CCL20 production in TNF-α/IFN-γ induced HaCaT cells. The cells were stimulated with 50 ng/mL of TNF-α/IFN-γ only, and TNF-α/IFN-γ plus cyclosporin (10 μM, positive control) or 70% EtOH, 95% EtOH extract (30 and 60 μg/mL) for 1 h. CCL17 and CCL20 protein production was determined by the Human CCL17/TARC Quantikine ELISA kit and Human CCL22/MDC Quantikine ELISA kit. The data represent the mean ± SD of triplicate experiments

Discussion and Conclusion

본 연구는 송라를 이용하여 피부질환을 개선하는 기능성 소재의 가능성을 확인하고자 항산화 및 항염증에 대해 조사하였다. 송라는 에탄올 함량을 낮춰가며 용매추출을 하였으며(100% 물, 30% 에탄올, 50% 에탄올, 80% 에탄올 및 95% 에탄올), 각각의 용매추출물 에 대한 항산화 효능인 DPPH 와 ABTS free radical 소거활성을 측정한 결과, 50% 에탄올, 70% 에탄올, 95% 에탄올 추출물이 다른 용매 추출물과 비교하여 우수한 항산화 활성을 가지는 것을 확인하였다. 특히 70% 에탄올, 95% 에탄올 추출물의 경우 다른 추출물과 비교하여 낮은 농도에서도 항산화 능력이 우수함을 확인하였다. 따라서 70% 에탄올, 95% 에탄올 추출물에 대해 피부각질 세포인 HaCaT 세포주를 이용해 피부염증 완화 효능을 검증하였다.

TNF-α/IFN-γ를 동시에 처리한 HaCaT 세포의 경우 염증성 피부질환과 밀접한 관련성이 있는 사이토카인인 CCL17과 CCL22의 단백질 수치가 증가하였으며, 70% 에탄올 95% 에탄올 추출물을 농도별로 처리시 농도의존적으로 감소되는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 보면, 항산화 활성이 높은 70% 에탄올, 95% 에탄올 추출물에서 항염이 우수한 활성을 나타내며 다른 추출물과 비교하여 활성물질이 다수 포함하고 있을 것으로 생각되며 추가적인 활성 물질에 관한 연구가 필요할 것으로 사료된다. 결론적으로 송라 70% 에탄올, 95% 에탄올 추출물은 향후 피부질환에 관련된 기능성 소재 및 민감성 피부관련 화장품 소재로서 사용될 가능성이 사료된다.

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